J3-2534

Reverzibilnost prehodne trombocitopenije izzvane s komponento kačjega strupa ponuja varno antitrombotično preventivo v interventni angiologiji in kardiologiji

Image
Datum:
01. septembra, 2019
Čas:
08:00 - 23:00
Lokacija:

Reverzibilnost prehodne trombocitopenije izzvane s komponento kačjega strupa ponuja varno antitrombotično preventivo v interventni angiologiji in kardiologiji (projekt financira ARRS: J3-2534)

Nosilna raziskovalna organizacija 312 – Univerzitetni klinični center Ljubljana
Raziskovalne organizacije – soizvajalke
106 – Institut “Jožef Stefan”
381 – Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
406 – Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta

Povzetek projekta

Pri trombemboličnih obolenjih, kot sta miokardni infarkt in ishemična kap, imajo trombociti poglavitno vlogo. Protitrombocitna oz. antigregacijska zdravila, ki jih trenutno uporabljamo, imajo neželen učinek – znižano število trombocitov, ki imajo hkrati tudi okrnjeno funkcijo. To predstavlja visoko tveganje za krvavitve, posebno pri uporabi antitrombotičnih zdravil v interventni kardiologiji in angiologiji.
V kliničnem delu projekta smo ugotovili izrazito in prehodno trombocitopenijo funkcionalnih trombocitov pri bolnikih, ki jih je ugriznil modras (Vipera a. ammodytes; Vaa). Ob tem smo predpostavili, da proteini podobni lektinom tipa C (snaclec), ki jih strup modrasa vsebuje v večjih količinah, lahko prehodno znižajo število trombocitov in ob tem ne prizadenejo njihove funkcije. V biokemičnem delu projekta smo iz strupa Vaa izolirali dva lektinom podobna proteina tipa C (Vaa-snaclec) in Vaa-snaclec-3/2 je inhibiral z ristocetinom povzročeno aglutinacijo trombocitov. Vaa-snaclec-3/2 je kovalentni heterodimer sestavljen iz monomerov Vaa-snaclec-3 (α-podenota) in Vaa-snaclec-2 (β-podenota). V ex vivo študijah smo pokazali, da se Vaa-snaclec-3/2 veže na trombocitni receptor GPIb in povzroči aglutinacijo trombocitov, kar povzroči trombocitopenijo. Proces je bil reverzibilen in pri tem nismo zaznali aktivacije trombocitov. V in vivo študijah v mišjem modelu arterijske tromboze je Vaa-snaclec-3/2 preprečil tvorbo trombocitnega strdka in zaščitil miši pred trombozo karotidne arterije, ki smo jo inducirali z železovim(III) kloridom.
Znanstveni izziv projekta je zahteval multidisciplinarno reševanje, ki je vključevalo klinične, farmakološke, biokemijske in imunološke raziskave, in sicer na kliničnem, predkliničnem in bazičnem raziskovalnem nivoju. V projektnem konzorciju smo sodelovali strokovnjaki s potrebnimi komplementarnimi znanji in z vso potrebno raziskovalno opremo iz Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, Instituta Jožef Stefan, Veterinarske in Medicinske fakultete v Ljubljani in Univerze v Zagrebu, zunanjega partnerja na projektu.
V sklopu projektu smo dosegli vse štiri glavne cilje: (1) pri bolnikih, ki jih ugriznil Vaa, smo odkrili komponento strupa, imenovano Vaa-snaclec, ki povzroča trombocitopenijo z reverzibilno aglutinacijo trombocitov; (2) iz strupa modrasa smo izolirali snaclec-3/2 in ga natančno biokemijsko okarakterizirali; (3) ugotovili smo način interakcije snaclec-3/2 s trombociti na molekulskem nivoju in predlagali mehanizem prehodne in reverzibilne trombocitopenije funkcionalnih trombocitov; in (4) ovrednotili klinični potencial snaclec-3/2 za preprečevanje arterijske tromboze v živalskem modelu.
Glavna dosežka projekta sta: (1) temeljita karakterizacija Vaa-snaclec-3/2 iz strupa modrasa, ki je pri bolnikih odgovoren za izrazito in prehodno trombocitopenije funkcionalnih trombocitov in (2) opis mehanizma delovanja snaclec-3/2 na molekulskem nivoju. Oba rezultata sta ključna za nadaljnji razvoj nove skupine antitrombotikov.

Projektna skupina:

1.  15595  Katarina Babnik  Tehnični sodelavec 
2.  24927  dr. Miran Brvar  Nevrobiologija  Vodja 
3.  38536  Mojca Dobaja  Javno zdravstvo (varstvo pri delu)  Raziskovalec 
4.  18122  Boštjan Drolc  Veterina  Tehnični sodelavec 
5.  12449  dr. Robert Frangež  Veterina  Raziskovalec 
6.  37918  Damjan Grenc  Nevrobiologija  Raziskovalec 
7.  50498  dr. Adrijan Ivanušec  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
8.  55063  Špela Koren  Biokemija in molekularna biologija  Mladi raziskovalec 
9.  00412  dr. Igor Križaj  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
10.  18802  dr. Adrijana Leonardi  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
11.  56248  Leja Perne  Biokemija in molekularna biologija  Tehnični sodelavec 
12.  20213  dr. Toni Petan  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
13.  04570  dr. Jože Pungerčar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
14.  18125  Jasna Šporar  Tehnični sodelavec 
15.  21553  dr. Jernej Šribar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
16.  07002  dr. Dušan Šuput  Nevrobiologija  Raziskovalec 
17.  13334  dr. Milka Vrecl Fazarinc  Veterina  Raziskovalec 
18.  56000  Mia Žganjar  Biokemija in molekularna biologija  Raziskovalec 
19.  22588  dr. Monika Cecilija Žužek  Veterina  Raziskovalec 

Reference projekta: 

  1. DOBAJA, Mojca, BABIĆ, Željka, CAGÁŇOVÁ, Blažena, GRENC, Damjan, KARABUVA, Svjetlana, KOLPACH, Zuzana, KRAKOWIAK, Anna, KOLESNIKOVA, Viktoriia, LUKŠIĆ, Boris, BRVAR, Miran (avtor, korespondenčni avtor), et al. Viper envenomation in Central and Southeastern Europe : a multicentre study. Clinical toxicology. 2023, vol. 61, iss. 9, str. 656-664. [COBISS.SI-ID 174628099]
  2. KURTOVIĆ, Tihana, KARABUVA, Svjetlana, GRENC, Damjan, DOBAJA, Mojca, KRIŽAJ, Igor, LUKŠIĆ, Boris, HALASSY, Beata, BRVAR, Miran. Intravenous Vipera berus Venom-specific Fab fragments and intramuscular Vipera ammodytes venom-specific F(ab’)2 fragments in Vipera ammodytes-Envenomed patients. Toxins : Elektronski vir. 2021, vol. 13, no. 4, str. 279-1-279-15 [COBISS.SI-ID 60217859]
  3. KURTOVIĆ, Tihana, LANG BALIJA, Maja, BRVAR, Miran, DOBAJA, Mojca, MATELJAK LUKAČEVIĆ, Sanja, HALASSY, Beata. Comparison of preclinical properties of several available antivenoms in the search for effective treatment of Vipera ammodytes and Vipera berus envenoming. Toxins : Elektronski vir. 2021, vol. 13, iss. 3, str. 1-11 [COBISS.SI-ID 56538115]
  4. DOBAJA, Mojca, GRENC, Damjan, REBERŠEK, Katarina, PODGORNIK, Helena, LEONARDI, Adrijana, KURTOVIĆ, Tihana, HALASSY, Beata, KRIŽAJ, Igor, BRVAR, Miran. Reversible and transient thrombocytopenia of functional platelets induced by nose-horned viper venom. Thrombosis Research. [Online ed.]. 2023, vol. 229, str. 152-154. [COBISS.SI-ID 170353411]
  5. DOBAJA, Mojca, POŽEK, Kity, GRENC, Damjan, LEONARDI, Adrijana, KURTOVIĆ, Tihana, REBERŠEK, Katarina, PODGORNIK, Helena, TRAMPUŠ-BAKIJA, Alenka, HALASSY, Beata, KRIŽAJ, Igor, BRVAR, Miran, et al. Reversible and transient thrombocytopenia induced by snake C-type lectin-like proteins (snaclecs) from nose-horned viper venom. Clinical toxicology. 2023, vol. 61, suppl. 1, str. 86. [COBISS.SI-ID 179011587]
  6. Dobaja M et al. Reverzibilna trombocitopenija funkcionalnih trombocitov povzročena s proteini, podobnimi lektinom tipa C, iz strupa modrasa. V: Fras Z. 29. sodobna interna medicina strokovno srečanje, 14.6.2023 v  Ljubljani: Medicinska fakulteta, 2023,91-92. {COBISS.SI-ID 191249923]
  7. DOBAJA, Mojca, LEONARDI, Adrijana, POŽEK, Kity, GRENC, Damjan, REBERŠEK, Katarina, PODGORNIK, Helena, TRAMPUŠ-BAKIJA, Alenka, ŽUŽEK, Monika C., FRANGEŽ, Robert, BRVAR, Miran, KRIŽAJ, Igor, et al. Reversible and transient thrombocytopenia induced by snake C-type lectinlike proteins (snaclecs) from nose-horned viper venom. V: SEPČIĆ, Kristina (ur.), PAVŠIČ, Miha (ur.). 15th Meeting of the Slovenian Biochemical Society with International Participation = 15. srečanje Slovenskega biokemijskega društva z mednarodno udeležbo : book of abstracts = zbornik povzetkov : Portorož, 20-23 September 2023 = [20.–23. september 2023, Portorož, Slovenija]. Ljubljana: Slovenian Biochemical Society: = Slovensko biokemijsko društvo, 2023. Str. 147. [COBISS.SI-ID 166614787]
  8. POŽEK, Kity, DOBAJA, Mojca, LEONARDI, Adrijana, GRENC, Damjan, KURTOVIĆ, Tihana, HALASSY, Beata, REBERŠEK, Katarina, PODGORNIK, Helena, TRAMPUŠ-BAKIJA, Alenka, ŽUŽEK, Monika C., FRANGEŽ, Robert, BRVAR, Mirjana, KRIŽAJ, Igor. Functional study of a novel thrombocytopenia-inducing C-type lectin-like protein from the venom of Vipera a. ammodytes. FEBS open bio. 2023, vol. 13, suppl. s2, str. 207. [COBISS.SI-ID 158349827]
  9. POŽEK, Kity, DOBAJA, Mojca, LEONARDI, Adrijana, GRENC, Damjan, KURTOVIĆ, Tihana, HALASSY, Beata, REBERŠEK, Katarina, PODGORNIK, Helena, TRAMPUŠ-BAKIJA, Alenka, ŽUŽEK, Monika C., FRANGEŽ, Robert, BRVAR, Mirjana, KRIŽAJ, Igor. Functional study of a novel thrombocytopenia-inducing C-type lectin-like protein from the venom of Vipera a. ammodytes. V: YSF FEBS 2023 abstract book : the 22th FEBS Young Scientists’ Forum, 6-8 July 2023, Tours, France. [S. l.]: The Federation of European Biochemical Societies, FEBS, 2023. Str. 95. [COBISS.SI-ID 159563523]
  10. Mojca Dobaja Borak, Adrijana Leonardi, Kity Požek, Katarina Reberšek, Helena Podgornik, Aljaž Pirnat, Alenka Trampuš Bakija, Monika C. Žužek, Robert Frangež, Miran Brvar, Igor Križaj. Reversible thrombocytopenia of functional platelets after nose-horned viper envenomation is induced by a snaclec: A promising antithrombotic in interventional angiology and cardiology. Journal of thrombosis and haemostais, 2024, poslano v objavo
  11. BRVAR, Miran, DOVČ, Alenka. Zdravstveno tveganje ob ugrizih kač : [predavanje na] One health, 5 december 2023, Veterinarska fakulteta, Ljubljana. [COBISS.SI-ID 190850307]
  12. KRIŽAJ, Igor. Živalski strupi – smrtonosni, a tudi koristni : predavano na dogodku “Muzejski večeri”, Idrija, 12.3.2024. [COBISS.SI-ID 190918147]
  13. KRIŽAJ, Igor. Živalski strupi – prekletstvo in blagoslov : 32 Dnevi Jožefa Stefana, “Kolokviji IJS”, Ljubljana, 21.3.2024. Ljubljana: Inštitut Jožef Stefan, 2024. [COBISS.SI-ID 190924035]
  14. BRVAR, Miran. Vsako leto zdravimo okoli deset ugrizov kač. Klinični center: interni časopis Kliničnega centra Ljubljana. 2021, št. 3, str. 17. [COBISS.SI-ID 102230275]
  15. KRIŽAJ, Igor (intervjuvanec). S kačjimi strupi nad bolezni. Gea : poljudnoznanstvena revija. [Tiskana izd.]. feb. 2024, letn. 34, str. 28-33, portreti. ISSN 0353-782X. [COBISS.SI-ID 186279939]
  16. KRIŽAJ, Igor (intervjuvanec), INTIHAR, Anja (oseba, ki intervjuva). S kačjimi strupi do zdravil prihodnosti. Nedelo. 2024, 16. marec. ISSN 1318-7023. [COBISS.SI-ID 190912259]
  17. KRIŽAJ, Igor (intervjuvanec), SLAČEK, Nina (oseba, ki intervjuva). Igor Križaj : Živalski strupi so vir najrazličnejših terapij : Oddaja Podobe znanja, program ARS, RTV SLO, 17. 11. 2023. [COBISS.SI-ID 187884291]

Bibliografske reference projektne skupine so dosegljivi na povezavi: https://bib.cobiss.net/bibliographies/si/webBiblio/bib351_20240407_113411_j3-2534.html

Poročilo o izvedbi projekta

V projektu smo potrdili hipotezo in dosegli cilje. Rezultate projekta smo predstavili na strokovnih  srečanjih ter objavili raziskovalne članke. Zadnji članek je bil poslan v revijo, vendar je še v procesu recenzije. 

DS2 – Klinični del  

DS2-N1: Vrednotenje reverzibilnosti števila trombocitov in njihove funkcije pri bolnikih po ugrizu modrasa

V sklopu projekta smo izvedli multicentrično raziskavo s katero smo potrdili, da ugriz modrasa (Vipera a. ammodytes; Vaa) pogosteje povzroči trombocitopenijo, kot ugriz gada (1). S tem smo potrdili, da se strupa modrasa in gada pomembno razlikujeta v snovi, ki povzroči  trombocitopenijo. V nadaljevanju smo s klinično in predklinično raziskavo različnih protistrupov potrdili, da protistrup izdelan proti strupu modrasa učinkoviteje odpravi trombocitopenijo, kot protistrup proti strupu gada, kar je potrdilo našo hipotezo, da predvsem strup modrasa vsebuje snov, ki povzroči trombocitopenijo (2-4). Naši izsledki so se skladali s primerjalno proteomsko raziskavo obeh strupov, ki je razkrila, da je poglavitna razlika v sestavi strupov prisotnost velike količine lektinom podobnih proteinov tipa C (snaclec) v strupu modrasa.

V projektu smo izvedli tudi prospektivno klinično raziskavo bolnikov, zastrupljenih po ugrizu modrasa, ki smo jih  zdravili s fragmenti F(ab)2 proti strupu modrasa. V raziskavo nam je uspelo zajeti 9 bolnikov, kar pomeni, da smo izpolnili pogoj 5 bolnikov, ki smo si ga določili. Pri bolnikih, zastrupljenih po ugrizu modrasa, smo s trombelastometrijo in agregometrijo potrdili pojav reverzibilne trombocitopenije z ohranjeno funkcijo trombocitov. S pretočno citometrijo trombocitov za detekcijo  markerjev aktivacije smo potrdili, da se trombociti med opaženo trombocitopenijo niso aktivirali. S klinično raziskavo smo tako ugotovili izrazito in prehodno trombocitopenijo funkcionalnih trombocitov pri bolnikih, ki jih je ugriznil modras, kar lahko pripišemo prisotnosti lektinom podobnih proteinov tipa C v strupu Vaa (Vaa-snaclec).

Rezultate kliničnega dela projekta smo objavili v članku z naslovom Reversible and transient thrombocytopenia of functional platelets induced by nose-horned viper venom (4). Rezultate kliničnega dela projekta smo predstavili tudi s predavanji na 43. kongresu evropskega združenja kliničnih toksikologov (EAPCCT) (5), 29. srečanju sodobne interne medicine (6), 15. srečanju Slovenskega biokemijskega društva z mednarodno udeležbo (7) ter kongresu Evropskega združenja biokemijske zveze (FEBS) (8,9).

DS2-N2: Določitev kinetike trombocitov in morebitnega mesta odlaganja (sekvestracije) trombocitov pri bolnikih, ki jih je ugriznil modras

Pri bolnikih s trombocitopenijo po ugrizu modrasa nam do oddaje poročila ni uspelo narediti scintigrafije z avtolognimi trombociti, označenimi z radioaktivnimi izotopi za določitev kinetike. Bolniki namreč niso ustrezali vključitvenim kriterijem, ki ji je odobrila Komisija za medicinsko etiko, ali pa so bili sprejeti v bolnišnico izven rednega delovnega časa, ko je priprava označenih trombocitov z radioaktivnimi izotopi izvedljiva.

DS3 – Biokemijski del 

Biokemijski del projekta smo izvedli v celoti, saj smo iz strupa modrasa izolirali protein, ki povzroča trombocitopenijo, snaclec 3/2, in ga biokemijsko okarakterizirali ter razkrili mehanizem delovanja na trombocite. Cilj je bil dosežen. Rezultate smo predstavili na kongresih (5-9) in poslali v objavo v revijo (10).

DS3-N1: Izolacija snaclecov iz strupa modrasa.

Za izolacijo snaclecov smo modrasov strup ločili z gelsko kromatografijo v 9 frakcij. Frakciji, ki vsebujeta molekule snaclec (B2 in B3) smo uporabili za nadaljnje ločevanje s postopki ionsko-izmenjevalne kromatografije na kolonah za anionsko in kationsko izmenjavo na sistemu za hitro proteinsko tekočinsko kromatografijo, ki ji je sledila ločba na koloni C18 na sistemu za visokotlačno tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z obrnjeno fazo (RP-HPLC). Izolirane frakcije smo analizirali s pomočjo NaDS-poliakrilamidne gelske elektroforeze in izoelektričnega fokusiranja. Z določitvijo navideznih molekulskih mas in izoelektričnih točk proteinov v frakcijah smo določili stopnjo njihove homogenosti.

DS3-N2: Biokemijska karakterizacija snaclecov modrasovega strupa.

V projektu smo izolirali Vaa-snaclec-3/2 kot heterodimer z navidezno molekulsko maso 25 kDa. Podenoti α in β sta med seboj povezani z disulfidno vezjo. Pod reduktivnimi pogoji na SDS-PAGE se je protein pojavil v dveh pasovih, pri 18 kDa in 15 kDa, prvi ustreza α-podenoti in drugi β-podenoti. Izoelektrična točka Vaa-snaclec-3/2 je bila 5.61. Za identifikacijo podenot molekul snaclec v izoliranih frakcijah smo uporabili N-terminalno sekvenciranje z Edmanovo razgradnjo in masno spektrometrijo (MS). Pred MS analizo smo proteine razgradili s tripsinom in dobljene peptide analizirali na tandemski način. Zbrane MS spektre smo analizirali s pomočjo računalniških programov Mascot in Spectrum Mill. Strukturne analize so pokazale, da smo izolirali heterodimer, sestavljen iz Vaa-snaclec-3 (UniProt ID: A0A1I9KNN1_VIPAA) kot podenota α in Vaa-snaclec-2 (UniProt ID: A0A1I9KNS2 _VIPAA) kot podenota β. Poimenovali smo ga Vaa-snaclec-3/2. V nadaljevanju smo podrobno okarakterizirali njegovo interakcijo s trombociti in določili mehanizem povzročitve trombocitopenije.

DS3-N3: Priprava specifičnih poliklonskih protiteles proti modrasovim snaclecom

Pripravili smo specifična poliklonska protitelesa proti modrasovim molekulam snaclec (Univerza v Zagrebu). Za imunizacijo podgan smo iz frakcije B po gelski kromatografiji modrasovega strupa izolirali kumulatino frakcijo snaclecov z uporabo RP-HPLC.

DS4 – In vitro študije  

DS4-N1: Ocena vplivov komponent modrasovega strupa na trombocite

S pomočjo optičnega mikroskopa smo potrdili nastanek skupkov trombocitov ob dodatku Vaa-snaclec-3/2. Z optičnim agregometrom smo raziskali vpliv izoliranega proteina na agregacijo/aglutinacijo trombocitov in pri tem uporabili plazmo bogato s trombociti (PRP) ter agoniste agregacije (ADP, kolagen, arahidonska kislina in ristocetin). Vaa-snaclec-3/2 je inhibiral le aglutinacijo trombocitov, povzročeno z ristocetinom, kar je pomenilo, da se snaclec-3/2 poveže s trombociti preko kompleksa GPIb–IX–V in/ali vWF.

DS4-N2: Identifikacija trombocitnih receptorjev, na katere se vežejo komponente modrasovega strupa

S pretočno citometrijo smo analizirali specifično vezavo molekul snaclec na trombocitne GP receptorje. Uporabili smo monoklonska protitelesa označena s fluorescein izotiocianatom in fikoeritrin cianinom, ki so bila usmerjena proti GPIb, GPIIb, GPIIIa in GPIX. Pripravili smo PRP ter z dodatkom fosfatnega pufra uravnali število trombocitov. S poskusi smo ugotovili, da se snaclec 3/2 veže na receptor GPIb in s tem povzroči aglutinacijo trombocitov in posledično navidezno znižanje njihovega števila. Pri tem jih ne aktivira – na trombocitih ni prišlo do izražanja označevalca aktivacije, P-selektina. Rezultate in vitro poskusov smo poslali v objavo v znanstveno revijo (10) in jih predstavili na mednarodnih srečanjih (7-9).

DS5 – In vivo študije  

V in vivo delu projekta smo vzpostavili mišji model arterijske tromboze, izzvane s FeCl3. Nastanek popolne okluzije v vratni arteriji smo potrdili z ultrazvočnim merilcem pretoka krvi. Mišji model tromboze smo uporabili za proučevanje antitrombotične aktivnosti molekul snaclec. V poskusih z različnimi koncentracijami Vaa-snaclec-3/2 smo določili odmerek snacleca, ki je popolnoma preprečil nastanek okluzije (20 µg/kg) (7-10).

DS5-N1: In vivo določanje vpliva komponent strupa Vaa na krvne parametre

Pri vseh živalih smo odvzeli vzorce krvi in izmerili število trombocitov (7-10). Vaa-snaclec-3/2 je povzročil trombocitopenijo.

DS5-N2: Histološko ocenjevanje vpliva komponent strupa Vaa na mišje organe

Pri vseh živalih v poskusu smo odvzeli organe za histološko analizo tkiv. Histološko analizo smo naredili. Rezultate pripravljamo za objavo.

DS5-N3: Vpliv komponent strupa Vaa na žilni pretok v primerjavi z antitrombotičnimi zdravili

Raziskavo določanja antiagregacijskega učinka Vaa-snaclec-3/2 v odvisnosti od odmerka smo zaključili. Ugotovili smo, da snaclec 3/2 pri odmerku 20 in 50 µg/kg popolnoma prepreči nastanek tromba in zmanjšanje pretoka krvi skozi vratno arterijo. Rezultate smo predstavili na kongresu (7-9), raziskovalni članek je bil poslan v objavo v znanstveno revijo (10).

DS6 – Diseminacija rezultatov

V sklopu projekta smo izvedli diseminacijo rezultatov, predvsem z objavami v znanstvenih revijah (1-4, 10) in tematskih konferencah (DS6-N1) (5- 9). Dodatno smo razvili komunikacijo s širšo javnostjo (DS6-N2) in rezultate predstavili na dogodkih One health (11), Muzejski večeri (12) in 32. dnevih Jožefa Stefana (13), in v poljubnih revijah Klinični center (14), Gea (15) in Nedelo (16) ter radijski oddaji Podobe znanja na RTV Slovenija (17). V teh primerih ni bilo možno navesti vira financiranja, saj je šlo za poljubne dogodke.

Potek projekta: